RESUMO
Diverse protein import pathways into mitochondria use translocons on the outer membrane (TOM) and inner membrane (TIM). We adapted a genetic screen, based on Ura3 mistargeting from mitochondria to the cytosol, to identify small molecules that attenuated protein import. Small molecule mitochondrial import blockers of the Carla Koehler laboratory (MB)-10 inhibited import of substrates that require the TIM23 translocon. Mutational analysis coupled with molecular docking and molecular dynamics modeling revealed that MB-10 binds to a specific pocket in the C-terminal domain of Tim44 of the protein-associated motor (PAM) complex. This region was proposed to anchor Tim44 to the membrane, but biochemical studies with MB-10 show that this region is required for binding to the translocating precursor and binding to mtHsp70 in low ATP conditions. This study also supports a direct role for the PAM complex in the import of substrates that are laterally sorted to the inner membrane, as well as the mitochondrial matrix. Thus, MB-10 is the first small molecule modulator to attenuate PAM complex activity, likely through binding to the C-terminal region of Tim44.
Assuntos
Proteínas de Transporte da Membrana Mitocondrial/antagonistas & inibidores , Proteínas de Saccharomyces cerevisiae/antagonistas & inibidores , Saccharomyces cerevisiae/efeitos dos fármacos , Animais , Sítios de Ligação , Testes Genéticos , Células HeLa , Humanos , Proteínas de Transporte da Membrana Mitocondrial/química , Proteínas de Transporte da Membrana Mitocondrial/metabolismo , Proteínas do Complexo de Importação de Proteína Precursora Mitocondrial , Modelos Moleculares , Simulação de Acoplamento Molecular , Simulação de Dinâmica Molecular , Neurospora crassa , Transporte Proteico/efeitos dos fármacos , Proteínas de Saccharomyces cerevisiae/química , Proteínas de Saccharomyces cerevisiae/metabolismo , Peixe-ZebraRESUMO
The mitochondrial disulfide relay system of Mia40 and Erv1/ALR facilitates import of the small translocase of the inner membrane (Tim) proteins and cysteine-rich proteins. A chemical screen identified small molecules that inhibit Erv1 oxidase activity, thereby facilitating dissection of the disulfide relay system in yeast and vertebrate mitochondria. One molecule, mitochondrial protein import blockers from the Carla Koehler laboratory (MitoBloCK-6), attenuated the import of Erv1 substrates into yeast mitochondria and inhibited oxidation of Tim13 and Cmc1 in in vitro reconstitution assays. In addition, MitoBloCK-6 revealed an unexpected role for Erv1 in the carrier import pathway, namely transferring substrates from the translocase of the outer membrane complex onto the small Tim complexes. Cardiac development was impaired in MitoBloCK-6-exposed zebrafish embryos. Finally, MitoBloCK-6 induced apoptosis via cytochrome c release in human embryonic stem cells (hESCs) but not in differentiated cells, suggesting an important role for ALR in hESC homeostasis.
Assuntos
Redutases do Citocromo/antagonistas & inibidores , Inibidores Enzimáticos/farmacologia , Regulação da Expressão Gênica no Desenvolvimento , Mitocôndrias/metabolismo , Proteínas de Peixe-Zebra/antagonistas & inibidores , Peixe-Zebra/metabolismo , Animais , Apoptose , Diferenciação Celular , Respiração Celular , Sobrevivência Celular , Redutases do Citocromo/genética , Redutases do Citocromo/metabolismo , Citocromos c/genética , Citocromos c/metabolismo , Edema Cardíaco/induzido quimicamente , Edema Cardíaco/genética , Edema Cardíaco/patologia , Embrião não Mamífero/efeitos dos fármacos , Embrião não Mamífero/embriologia , Embrião não Mamífero/patologia , Células HEK293 , Células HeLa , Humanos , Testes de Sensibilidade Microbiana , Mitocôndrias/efeitos dos fármacos , Proteínas de Transporte da Membrana Mitocondrial/genética , Proteínas de Transporte da Membrana Mitocondrial/metabolismo , Proteínas Mitocondriais/antagonistas & inibidores , Proteínas Mitocondriais/genética , Proteínas Mitocondriais/metabolismo , Morfolinos/farmacologia , Oxirredução , Oxigênio/metabolismo , Transporte Proteico , Especificidade por Substrato , Leveduras/efeitos dos fármacos , Leveduras/genética , Leveduras/metabolismo , Peixe-Zebra/crescimento & desenvolvimento , Proteínas de Peixe-Zebra/genética , Proteínas de Peixe-Zebra/metabolismoRESUMO
A concise synthesis of the N-methylwelwitindolinone C isothiocyanate scaffold is disclosed. The approach relies on an indolyne cyclization to construct the [4.3.1]-bicyclic ring system present in the natural product. Subsequent oxidation of the indole core occurs with excellent diastereoselectivity to afford oxindole 2, the structure of which was confirmed by X-ray crystallographic analysis.
